Читать
Отчет по оценке эффективности применения в отношении снижения неферментативного гликирования и коррекции дефицита...
#Исследования подтверждают15 дек. 2023
#Исследования подтверждают
19 янв. 2022
Организация
С(А)ФУ Центр коллективного пользования научным оборудованием «Арктика, 2020 г.
Результаты исследования Центром коллективного пользования научным оборудованием «Арктика» экстракта фукуса на содержание аминокислот и витаминов
Заказчик: ООО «Архангельский водорослевый комбинат» Наименование объекта исследования:
| Шифр проб | Обозначение проб заказчиком |
|---|---|
| 206-L |
Экстракт фукуса |
Дата поступления: 26.03.2020
Дата оформления протокола: 06.04.2020
Техническое задание:
- Определение содержания аминокислот (изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, цистин, глицин, гистидин, глутаминовая кислота, пролин, таурин, тирозин, серин);
- Определение содержания водорастворимых витаминов В1,В2,ВЗ,В6,В7,В12,С.
Результаты измерения:
Количественное определение аминокислотного состава пробы 206-L проводили методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией с нингидрином.
Анализ выполнялся с использованием аминокислотного анализатора Biochrom 30+ (Biochrom, Великобритания). Разделение проводили на хроматографической колонке Sodium High Performance Protein Hydrolysate Column (Biochrom, Великобритания), 4.6х150 мм. В качестве подвижной фазы использовались натриевые буферные растворы:
| № Буфера | Компонент | Концентрация, Моль | pH |
|---|---|---|---|
| 1 | Натрий-цитратный буфер (А) | 0,20 | 2,80 |
| 2 | Натрий-цитратный буфер (В) | 0,30 | 3,00 |
| 5 | Натрий-цитратный буфер | 1,65 | 3,55 |
| 6 | Раствор гидроксида натрия | 0,30 | - |
Элюирование аналитов проводили по следующей программе переключения буферных растворов:
| № | Время, мин | Температура, °С | Буфер | Скорость потока, мл/ч |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 1,0 | 48 | 1 | 25,0 |
| 2 | 21,0 | 48 | 2 | 25,0 |
| 3 | 20,15 | 52 | 2 | 25,0 |
| 4 | 0,45 | 52 | 5 | 25,0 |
| 5 | 20,0 | 95 | 5 | 25,0 |
| 6 | 4,0 | 95 | 6 | 25,0 |
| 7 | 4,0 | 95 | 1 | 25,0 |
| 8 | 2,0 | 48 | 0 | 0,0 |
| 9 | 8,0 | 48 | 1 | 33,0 |
| 10 | 4,0 | 48 | 1 | 25,0 |
В качестве дериватизирующего агента выступал раствор нингидрина (Sevko&Co, Россия), скорость подачи - 20 мл/ч. Температура реакционной ячейки 135 °С. Объем вводимой пробы - 20 мкл. Детектирование проводили спектрофотометрически на длинах волн 440 и 570 нм.
Калибровку системы осуществляли с использованием стандартного раствора аминокислот (Sigma-Aldrich, США) с концентрацией каждой аминокислоты 2,5 мкМоль/мл, разбавленного в 10 раз загрузочным буферным раствором с pH 2,20 (Biochrom, Великобритания).
Пробоподготовка. 1 мл экстракта водорослей (образец 206-L) разбавляли в 10 раз натрий-цитратным загрузочным буфером с pH 2,20, центрифугировали в течение 5 минут при 14 000 об/мин, фугат отфильтровывали с помощью нейлонового мембранного фильтра (размер пор 0,22 мкм) и вводили в хроматографическую систему.
Результаты определения содержания аминокислот в образце 206-L:
| Компонент | Концентрация аминокислот в пробе, мг/л |
|---|---|
| Аспаргиновая кислота | 63 ±5 |
| Треонин | 96 ±8 |
| Серин | 348 ±28 |
| Глутаминовая кислота | 247 ± 26 |
| Пролин | 135 ±11 |
| Глицин | 36 ±4 |
| Аланин | 1145 ±98 |
| Цистеин | 41 ±5 |
| Валин | 146 ± 12 |
| Метионин | 18 ± 2 |
| Изолейцин | 53 ±4 |
| Тирозин | 59 ±5 |
| Фенилаланин | 107 ±9 |
| Гистидин | 9,7 ± 0,9 |
| Триптофан | -* |
| Лизин | 11 ±1 |
| Хлорид аммония | 1280 ±125 |
| Аргинин | 127 ±11 |
| Таурин | -** |
Примечание:
*- не обнаружено
** - таурин не определялся ввиду отсутствия стандартного образца для калибровки системы.
Количественное определение витаминов.
Пробоподготовка: жидкие пробы (1 мл) фильтровали через мембранный нейлоновый фильтр (0,2мкм) и вводили в систему ВЭЖХ-МС/МС.
Пастообразные/твердые образцы подвергали экстракции согласно [1]:
Взвешивали 0,1 г образца в виале на 15 мл, добавляли 4,6 мл воды и 0,4 мл NaOH 2 М и энергично встряхивали суспензию, затем 5 мл фосфатного буфера 1 М (дигидрофосфат моногидрат). Обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин в ультразвуковой ванне Elmasonic S15H (Elma, Германия). Экстракт фильтровали через мембранный нейлоновый фильтр (0,2мкм) и вводили в систему ВЭЖХ-МС/МС.
Так как экстракт водорослей оказался сложной матрицей, решили отказаться от использования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием. Определение водорастворимых витаминов проводили методом ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (МС/МС).
Использовали систему ВЭЖХ-МС/МС, состоящая из тандемного массспектрометра с тройным квадруполем LCMS-8040, оснащенного источником ИЭР, а также жидкостного хроматографа LC-30 «Nexera» (Shimadzu, Япония), включающего два насоса LC-30AD с формированием градиента на стороне высокого давления, пятиканальный дегазатор DGU-A5, автосамплер LC-30AC, термостат колонок СТО-З0А. Управление системой ВЭЖХ-МС/МС, сбор и обработка данных осуществлялись с помощью программного пакета LabSolutions 5.65 (Shimadzu, Япония).
Разделение проводили на неподвижной фазе Zorbax SB-Aq, 150х3,0 мм, размер частиц сорбента 3,5 мкм (Agilent, США), при 35°С и 0,6 мл/мин. В качестве элюента использовалась смесь 0,1% водного раствора муравьиной кислоты (раствор А) с ацетонитрилом (раствор В). Градиентная программа: 0-5 мин 0% В, 15 мин: 30% В.
Результаты определения:
| Соединение | Время, мин | Ионный переход, m/z | 206-L, мг/л |
|---|---|---|---|
| В6 пиридоксамин | 1,378 | 169,00>152,00 | менее ПО |
| С аскорбиновая кислота | 1,748 | 175,00>115,00 | 0,2 |
| В1 тиамин |
2,25 | 265,00>122,00 | 0,006 |
| В6 пиридоксаль | 2,346 | 168,00>150,00 | 0,023 |
| В6 пиридоксин | 2,743 | 170,00>134,00 | 0,152 |
| ВЗ никотинамид | 3,682 | 123,00>80,00 | 1,271 |
| В7 биотин | 12,467 | 245,00>227,00 | 0,003 |
| В2 рибофлавин | 12,558 | 377,00>243,00 | 1,777 |
| В12 цианокобаламин | 12,848 | 678,00>147,00 | менее ПО |
Примечание:
ПО – предел обнаружения 0,01 мг/л
